大家好！今天小编跟大家分享的是一篇于2023年1月同我司合作发表在Biochemical Genetics杂志（IF: 2.4）的文章案例《Identification of lncRNA-miRNA-mRNA Regulatory Network and Therapeutic Agents for Skin Aging by Bioinformatics Analysis》。
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皮肤衰老是人体老化最直观的表现，不仅可能导致美观和心理问题，甚至转化成疾病。本研究旨在研究皮肤衰老的病理和分子机制，并确定逆转皮肤衰老的治疗药物。对皮肤衰老基因表达数据集（GSE55118和GSE72264）进行生物信息学分析。首先，通过WGCNA网络分析识别出与皮肤衰老密切相关的169个关键mRNAs、27个关键miRNAs和50个关键lncRNAs。然后，通过Metascape数据库执行的功能富集分析显示，皮肤衰老涉及多种生物功能，如刺激检测、对类固醇激素的响应、水通道活性、肌肉收缩的调节。接下来，通过PPI相互作用分析筛选出10个中心基因，包括AQP4，TRPM8，TBR1，NTSR2，MPPED1，BARHL2，PAX9，CPN1，CES3，和CHGB。接下来，构建了“lncRNA-miRNA-mRNA”网络和“lncRNA-miRNA-中心mRNA”网络，以探索皮肤衰老的竞争性内源性RNA机制。最后，通过CMAP平台筛选出10种显著的可能缓解皮肤衰老的小分子，包括维生素A酸、吡非胺、司拉克丁、恩替诺特、溴他西尼、丁香酸、BRD-K9647565、依美斯汀、阿巴卡韦和鱼腾酮，并通过分子对接实验验证了它们的可靠性。本研究为揭示皮肤衰老的分子机制提供了基础，并确定了可能的缓解皮肤衰老的候选药物。
背景介绍
作为人体最大的器官，皮肤会随着生物学年龄的增长而表现出老化。随着人类寿命的延长，老龄化社会的到来以及公众对美的认识，探索皮肤衰老的原因以及如何延缓其老化过程已经成为化妆医学领域的一个热点。此外，随着人们年龄的增长，人类皮肤的形态结构和生理功能会发生退行性变化。皮肤衰老是许多疾病的风险因素。老年人的皮肤容易干燥、发痒、色素沉着、皱纹以及良性和恶性肿瘤。因此，保持我们的皮肤健康有助于促进健康老龄化。
皮肤衰老是一个复杂且持续的生物学过程，其特点包括表皮变薄、弹性组织退化、黑色素细胞数量减少和屏障功能受损，表现为皱纹、弹性减退、干燥和色素沉着障碍。许多内在和外在因素都会导致皮肤衰老。外源性老化主要是由电离和非电离辐射、空气污染、自然有害气体（例如臭氧和高氧浓度）、吸烟、病原细菌入侵、病毒以及其他因素引起的。其中，长期反复暴露于阳光中的紫外线（UV）是环境中影响皮肤衰老的最重要因素。此外，内源性老化，也称为自然老化，是由内在因素引起的衰老，包括衰老、生理老化、皮肤合成胶原蛋白和弹性蛋白的能力下降，以及细胞质和细胞间基质的活动性下降。
皮肤衰老的机制复杂，许多理论已被提出来解释老化的机制，如老化基因理论、自由基理论和线粒体理论。近年来，随着测序技术的发展，通过比较年轻人和老年人之间的皮肤差异，已经鉴定出许多老化基因，这为研究皮肤衰老生物标志物和分子机制提供了基础。作为皮肤衰老的一个重要生物标记，已发现水通道蛋白（AQPs）的低表达是皮肤衰老的风险因素，并且 AQPs 通过调节皮肤表皮细胞的增殖和分化可以延缓皮肤的过早衰老。
竞争内源性RNA（ceRNA）是竞争与同一miRNA结合的转录本，随后调控相关靶基因的表达，在生理和病理状态下的许多细胞过程中发挥重要作用。根据ceRNA理论，lncRNA可以作为miRNA海绵调控mRNA表达，调节下游分子过程（lncRNA表达分析冠心病患者心外膜脂肪组织和相关的ceRNA网络分析）。已有研究证明，ceRNA机制是皮肤衰老的重要分子机制。例如，研究者发现“lncRNA-miRNAmRNA”信号可能通过调节TNF信号通路和甲状腺激素信号通路来影响皮肤衰老。LncRNA RP11-670E13.6可作为海绵结合microRNA-663a响应元件，进一步调节Cdk4和Cdk6的表达，诱导皮肤损伤延迟细胞衰老。然而，关于ceRNA参与皮肤衰老的机制的研究仍然很少。因此，深入研究ceRNAs的调控机制，有助于揭示皮肤衰老的调控机制。
近年来，药学科学家在现有药物知识的基础上大力开发新的抗衰老药物。然而，由于成本高、耗时工作，大多数时间无法进行体外或体内研究。相反，由于最近在基于细胞的表型筛选和大量基因组数据分析方面的技术进步，基于生物信息学分析的虚拟筛选为新药的开发提供了便利。连接图（Cmap）包含了经生物活性小分子处理的人类细胞的转录组数据，是一个可靠的生物信息学程序，用于预测各种疾病的潜在药物。
本文利用微阵列数据研究了与皮肤衰老密切相关的基因，然后探索了这些基因的生物学功能，并构建了ceRNA网络。研究结果将在一定程度上揭示皮肤衰老的分子机制。此外，Cmap作为一种有效的药物基因组药物发现工具，被用于筛选潜在的缓解皮肤衰老的候选药物。
方法解读
1. 从GEO数据库下载两个GSE片段（GSE55118和GSE72264）。GSE55118数据是lncRNA和mRNA数据集，包含5名年轻健康志愿者（20-30岁）和5名中年健康志愿者（40-50岁）以及5名老年健康志愿者（60-70岁）的皮肤标本。GSE72264是一个miRNA数据集，包含来自6名年轻健康志愿者（10岁以下）和6名老年健康志愿者（60岁以上）的皮肤标本。
2. 使用WGCNA方法分别对GSE55118和GSE72264数据集进行分析，设置合适软阈值β过滤基因和样本，构建基因共表达网络。计算每个模块与临床特征的相关性，获得与皮肤衰老高度相关的基因模块并鉴定出关键基因。
3. 将GSE55118中鉴定的关键基因用于GO注释、KEGG通路、维基通路和贺曼基因集富集分析。
4. 使用STRING和Cytoscape构建GSE55118数据集中关键mRNA的PPI网络，并基于MCC算法识别10个核心基因。
5. 使用miRTarbase工具和miRNet数据库预测加权关键lncRNA和基因共表达网络分析筛选的mRNA之间的相互作用，并构建ceRNA网络。数据可视化采用Cytoscape软件。
6. 使用CMap数据库筛选可能逆转与皮肤衰老有关的核心基因表达的小分子化合物。
7. 使用Discovery Studio 2019 software 验证小分子药物的预测结果的可靠性。
结果分析
1 WGCNA识别关键的mRNA和LncRNA
作者首先将GSE55118的数据经过标准化（图1A）和差异分析，并通过WGCNA构建共表达模块。选择最佳软阈值β为9（图1B）。这些具有相似表达模式的基因被放入一个模块中。经过层次聚类和模块合并，确定10个模块（图1C）。分析了这10个基因共表达模块之间的相互作用关系，结果表明，不同模块之间的关系没有任何明显的差异，表明模块和每个模块中的基因是独立的（图1D）。然后，对模块特征基因（MEs）的连通性进行分析，结果显示每个模块具有较高的特殊性（不相似度<0.2）（图1E）。关于模块-性状相关系数发现，除灰色模块外，所有模块都与皮肤衰老高度相关（p value<0.05）（图1F）。
以|GS|>0.85和|MM|>0.85和p value<0.05作为揭示关键基因的标准，共鉴定出219个与皮肤衰老高度相关的关键基因，包括169个关键mRNA和50个关键lncRNA。在这些关键基因中，包含23个lncRNA和91个mRNA的114个基因的表达与皮肤衰老呈正相关，而包含27个lncRNA和78个mRNA的105个基因的表达与皮肤衰老呈负相关（图2）。
图1. GSE55118的WGCNA (A) GSE55118数据的标准化。(B）软阈值β和无标度网络建设。(C) 聚类树状图。(D) 拓扑重叠测量（TOM）矩阵的热图。(E) 基因共表达网络中邻接点的热图。(F) 模块特征基因与临床特征（年龄）相关性的热图。
图2. (A) GSE55118数据集169个关键mRNA的表达热图。(B) GSE55118数据集中50个关键lncRNA的热图。红点表示高表达RNA，绿点表示低表达RNA
2 功能富集分析
使用Metascape数据库对GSE55118中识别的219个关键基因(169个关键mRNA和50个关键lncRNA)进行了功能富集分析。结果显示，这些关键基因富集于191个生物学过程、33个细胞组分、33个分子功能、7个基因集 Hallmark、8个KEGG通路和9个Wiki通路。关键基因主要参与对刺激的检测、对类固醇激素的响应、水通道活性、肌肉收缩的调节、受体配体活性、解剖结构大小的调控、细胞顶端部分、过渡金属离子运输、核受体激素活性、心血管疾病发病假说通路、穿膜钙离子运输、对外部刺激的检测、眼感光受体细胞发育、淋巴细胞激活的调节、前脑发育、防御反应的调节、蛋白多糖结合、ERAD通路、肌肉收缩的正调控、膜固定组分（图3）。
图3. GSE55118中识别出的关键基因的功能富集分析 (A) 富集度排名前20的条形图 (B) 富集项的网络
3 PPI网络的构建与hub基因的选择
作者将WGCNA网络中识别出的169个关键mRNA用于进行PPI网络分析(图4A)。根据MCC算法，从CytoHubba插件的PPI网络中筛选出十个顶级核心基因，顺序排列如下：AQP4、TRPM8、TBR1、NTSR2、MPPED1、BARHL2、PAX9、CPN1、CES3和CHGB(图4B)。功能富集分析显示，10个hub基因富集于10个生物学过程，包括对皮质醇的响应、对皮质类固醇的响应、对类固醇激素的响应、对激素的响应、细胞化学稳态、细胞稳态、细胞大小的调节、细胞组分大小的调节、解剖结构大小的调节和细胞命运决定，以及1个基因集Hallmark，即小分子的运输(图4C)。
在10个核心mRNA中，9个核心mRNA的表达与年龄呈负相关，包括AQP4、TRPM8、TBR1、NTSR2、MPPED1、BARHL2、PAX9、CES3和CHGB。核心基因CPN1在中年组或老年组中均显著上调(图5)。
图4. 蛋白互作网络构建和核心基因筛选 (A) 蛋白质互作网络。颜色越深的节点在网络中的度数分值越高。(B) 从蛋白质互作网络中筛选出的10个核心基因。节点根据MCC评分排名，颜色越深红表示MCC评分越高。(C) 10个核心基因的功能富集分析
图5. Hub基因在GSE55118数据集中的表达情况
4 WGCNA识别关键的miRNAs
作者对GSE72264基因表达矩阵中的所有1350个基因都用于基因WGCNA分析以便筛选出关键miRNAs(图6A)。最佳软阈值β设置为9(图6B)。按动态剪枝树进行模块赋值后，构建了7个模块，包括蓝色、棕色、绿色、灰色、红色、青绿色、黄色模块，分别包含86、39、37、66、36、1048和37个基因(图6C)。模块及每个模块中的基因是独立的(图6D)。基于ME聚类树和热图结果，表明模块之间的连接性不强(图6E)。在7个模块中，蓝色模块与皮肤衰老显著相关(r=0.94和p值=4e-06)(图6F)。
从蓝色模块中，GS>0.85和|MM|>0.85且p值<0.05的27个miRNA被定义为皮肤衰老发展中的关键miRNA。作者进一步分析了这些关键miRNA在年轻组和老年组中的差异表达。结果显示，与年轻组相比，老年组中6个关键miRNA下调，21个关键miRNA上调(图7)。
图6. GSE72264的WGCNA分析 (A)GSE72264数据的标准化 (B)软阈值功率筛选和无尺度网络构建 (C)聚类树形图 (D)网络拓扑重叠度量(TOM)矩阵的热图 (E)基因共表达网络中邻接矩阵的热图 (F) 模块特征基因与临床特征(年龄)之间相关性的热图
图7. GSE55118数据集中27个关键miRNA的表达热图。红色表示高表达，绿色表示低表达
5 ceRNA网络的建设
为了预测目标基因和lncRNA，作者将27个关键miRNA上传到miRTarBase和TargetScan数据库。然后，与GSE55118中识别的169个关键mRNA和50个关键lncRNA进行比较，识别出63个共同mRNA和6个共同lncRNA，随后识别出与共同mRNA和lncRNA作用的9个关键miRNA。共识别出6个关键lncRNA、9个关键miRNA和63个关键mRNA之间的相互作用，并使用Cytoscape软件构建“lncRNA-miRNA-mRNA”网络。“lncRNA-miRNA-mRNA”网络包含136对miRNA-mRNA相互作用和19对miRNA-lncRNA相互作用(图8A)。
由于中心基因在PPI网络中起着关键作用，中心基因的ceRNA机制可能在皮肤衰老的进展和逆转中发挥重要作用。因此，从“lncRNA-miRNA-mRNA”网络中识别出中心mRNA及其相关miRNA和lncRNA之间的相互作用，构建“lncRNA miRNA中心mRNA”网络。“lncRNA miRNA中心mRNA”网络由9个lncRNA、6个miRNA和4个mRNA组成，包含22对交互关系，包括8对miRNA-mRNA相互作用和14对miRNA-lncRNA相互作用(图8B)。
图8. ceRNA网络构建 (A) “lncRNA-miRNA-mRNA”网络。红色四边形代表lncRNA，蓝色菱形代表miRNA，绿色椭圆代表mRNA (B) “lncRNA-miRNA-中心mRNA”网络的桑基图。
6 药物筛选与分子对接
为了筛选可能逆转皮肤衰老的潜在药物，作者将GSE55118中识别的169个关键mRNA上传到CMAP。前10个最显著的潜在小分子药物是维生素A酸、吡非胺、司拉克丁、恩替诺特、溴他西尼、丁香酸、BRD-K9647565、依美斯汀、阿巴卡韦和鱼腾酮(表1)。
为了探索上述通过筛选获得的小分子是否能直接靶向与皮肤衰老相关的基因，作者进一步选择了hub基因AQP4用于分子对接分析。Discovery Studio 2019软件计算的LibDock Score和AutoDock Vina软件计算的结合能量显示在表2中。所有小分子与AQP4的相互作用的LibDock Score≥70，所有结合能量≤-5.0 kcal/mol。结果表明这些分子与AQP4具有良好的靶向潜力。结合能量最低的5个对接结果显示在图9中。分子对接的结果在一定程度上验证了药物预测的准确性。
表1 模块基因的小分子鉴定（前10位）
表2 10个小分子与AQP4之间的分子对接
图9. 与AQP4对接的5个最相关小分子的分子对接 (A) BRD-K96475865 (B) 司拉克丁 (C) 鱼腾酮 (D) 恩替诺特 (E)溴他西尼
结论
本研究通过WGCNA网络分析识别了与皮肤衰老密切相关的169个关键mRNA、27个关键miRNA和50个关键lncRNA。这些关键基因可能作为皮肤衰老的生物标志物，并为揭示皮肤衰老的分子机制提供依据。研究者确定了一些与皮肤衰老相关的信号通路，如参与刺激的检测、对类固醇激素的反应、水通道活性、肌肉收缩的调节、受体配体活性等。从PPI网络中共选出了10个核心基因，包括AQP4、TRPM8、TBR1、NTSR2、MPPED1、BARHL2、PAX9、CPN1、CES3和CHGB。值得注意的是，这些核心基因可能在皮肤衰老的过程和逆转中起关键作用。
作者为了探究核心基因在皮肤衰老中的重要作用，构建了“lncRNA-miRNA-mRNA”网络，识别出诸如“LOC100291323-hsa-mir-34a-5p-PAX9”和“LOC643339-hsa-mir-106b-5p-AQP4”等核心ceRNA机制。此外，利用CMAP平台筛选出10个显著的潜在抗皮肤衰老小分子，包括维生素A酸、吡非胺、司拉克丁、恩替诺特、溴他西尼、丁香酸、BRD-K9647565、依美斯汀、阿巴卡韦和鱼腾酮。维甲酸作为一种抗衰老皮肤药物已被研究者广泛讨论。吡非胺可以通过抑制p53的表达改善UVB致黑色素细胞衰老和色素沉着也曾被报道。总的来说，该研究揭示了皮肤衰老的潜在分子病理机制，并基于生物信息学的方法研究了逆转皮肤衰老的治疗药物。然而，其他小分子药物对皮肤衰老的作用和机制仍不清楚，需要更多的体内和体外实验进行验证。
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